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3R原则与生物制品行业的未来

武汉生物制品研究所有限责任公司 严家新 研究员
摘要
3R原则就是大力发展动物实验替代方法,做到善待动物,尽量少用或不用动物。3R的具体内容包括实验动物的减少(Reduction)、替代(Replacement)和优化(Refinement),简称3R 。
作为国际动物保护组织数十年来长期倡导3R原则的结果,欧盟委员会于2013年3月11日下令,自即日起全面禁止与化妆品相关的动物试验,凡在生产和检定过程中使用了动物的化妆品都严禁在欧盟范围内销售。
生物制品行业也是使用实验动物最多的行业之一,化妆品行业的上述遭遇,成为生物制品行业的前车之鉴。生物制品行业也必须正视3R原则对本行业现状的挑战,未雨绸缪,作好全面规划,大力加强有关动物实验替代方法的研究和推广,以确保生物制品行业能有更美好的未来。
目录
​1.动物福利与3R原则
2. 3R原则的来源和发展
3.前车之鉴–欧盟全面禁止化妆品动物实验
4.未雨绸缪–生物制品行业也要大力倡导3R 原则
5.狂犬病疫苗效力检定的替代方法
6.与动物保护组织携手前行

 

1.  动物福利与3R原则
印度国父甘地曾说:“看一个国家是否文明,就看这个国家的人民对待动物的态度”。
与西方发达国家相比,动物福利在中国目前还是一个较新的概念,存在一些争议。有相当一部分人还认为,动物保护是富人的游戏,需在达到一定的社会经济发展水平后才能提上议事日程。在中国的许多地区和领域,目前连人的福利都没有保障,哪能保障动物福利?
动物保护组织的人士则认为,必须抛弃那种以人的福利为前提来衡量动物福利的做法。尊重生命、善待动物、不虐待动物的理念直接源于一百多年来人类在道德、伦理方面的思考和进步,是精神文明建设的需要,是势不可挡的世界潮流。
中国生物制品行业的从业人员,在考虑动物实验与3R原则的关系时,也面临着与时俱进、主动转变观念、正确认识动物福利的问题,而不应当仅仅只是被动地考虑因违背3R原则可能会导致产品失去市场、从而影响本行业未来发展的问题。

2.   3R原则的来源和发展
创建于1926年的英国动物福利大学联合会(UFAW)的Charles Hume教授于1954年制定了一项有关动物试验人道主义技术的科学研究计划。1959年出版的《人道主义试验技术原理》一书,第一次全面系统地提出了3R(减少-替代-优化)原则。
减少是指尽可能地减少实验中所用动物的数量,提高实验动物的利用率和实验的精确度;或使用一定数量的动物能获得更多试验数据。
替代就 是用体外方法或没有感觉的生物学材料替代活体动物。前者是用非生命的体外实验代替活体实验,如免疫学ELISA实验、分子生物学PCR方法,以及细胞芯 片、电脑模拟等。后者是以微生物或细胞、组织、器官来代替多细胞的生物个体,或以低等动物代替高等动物(如用鱼来替代灵长类动物)。
优化”是指通过改进和完善实验程序,避免、减少或减轻给动物造成的疼痛和不安(如采用止痛剂、麻醉剂、安乐死);或为动物提供适宜的生活条件,增进动物的健康和快乐,提升实验动物的福利水平,并确保动物实验结果的可靠性。
3R”原则最终能使实验动物的使用量逐步减少,同时实验结果的准确性、可靠性也不断提高。“3R”原则反映了实验动物科学的现代发展趋势:不仅在技术上要有更严格的要求,同时要加强对动物的人道主义管理。
“3R”原则在发达国家已经普遍采用,并被许多国家列入保护动物的法律中。1989年欧洲通过了使3R更为具体化的动物保护法。1993年在意大利成立了由15个国家参加的欧洲替代方法验证中心(ECVAM)。2012年,英国废除活体解剖联盟创建了第一家致力于终止全球化妆品动物实验的全球性机构 Cruelty Free International。提倡实验动物福利与动物保护已成为国际大趋势。
3.    前车之鉴–欧盟全面禁止化妆品动物实验
欧盟委员会于2013年3月11日下令从即日起全面禁止在动物身上进行化妆品测试,并正式宣布在欧盟范围内禁止进口和销售通过动物试验生产的化妆品及原料
该项禁令是动物保护组织多年来不断努力的结果,该禁令适用于在欧盟27个成员国销售的包括肥皂和牙膏在内的所有化妆品及其原料。
欧洲化妆品行业规模达每年700亿欧元(约合每年910亿美元)。
目前我国还没有实施3R原则,这就意味着我国所有化妆产品已完全退出欧洲市场。
欧盟还特别希望美国和中国在本国也采纳并推行该项禁令。欧盟还将尝试说服世界其他地区的贸易伙伴跟随欧洲的行动。
中国的化妆品行业如不实施3R原则,如果中国政府也采纳并推行欧盟的该项禁令,则中国的整个化妆品行业就要失去国内外的所有市场,即彻底消亡。
预计全球其它地区将跟随这一趋势,逐步禁止进口和销售通过动物试验生产的化妆品及原料。这种趋势将来还很可能扩展到生物制品行业。
4.    未雨绸缪–生物制品行业也要大力倡导3R 原则
近年来,国际上多次召开与生物制品和3R有关的会议,我国相关部门的负责人也大都曾参加。
例如,2011年8月,在加拿大蒙特利尔举办了第八届生命科学研究中动物实验替代方法国际大会,中国食品药品检定研究院实验动物管理处处长贺争鸣等曾参加。
据会议提供的资料,近年来,有关生物制品检验中动物实验的替代方法研 究工作发展较快,不少国家在这方面开展了研究工作。如:古巴的主要疫苗生产基地芬利研究所(The Finlay Institute)和其他科研院所,十几年来一直努力将最新的3R方法引入疫苗效力评价和毒性检验的经典动物实验。降低动物使用量、优化检测程序、建立 攻毒效力实验(challenge potency test)和其他动物实验的替代方法已成为疫苗领域中实施3R原则的重点方向。
在 生物制品的批签发中,须使用大量的实验动物以阐明产品的安全性和效价。如何发展3R方法、细胞学方法和血清学实验替代传统的动物实验方法,从而取消对致死 性指标的要求是一个任重而道远的理想目标。最近,一致性检验(ConsistencyTesting)作为减少动物使用量的有效策略已被欧洲动物实验替代 方法合作联盟(EuropeanPartnership on Alternative Approaches, EPAA)认可。
家 兔法热原检测的替代方法研究仍是研究热点之一。德国国家疫苗及血清研究所(Paul-Ehrlich-Institut)在利用鲎试剂鉴定法 (LimulusAmebocyte Lysate,LAL)替代兔实验用于内毒素(LPS)的定量检测方面作过深入的研究。然而由于栖息地减少、污染和商业捕捞,所有鲎种都面临灭绝,野生的 鲎种群已不能满足对鲎试剂日益增长的需求,从而使药物安全性评估面临重大问题。因此,亟需将已经过验证的单细胞激活检测/MAT和重组LAL检测方法应用 于热原检测中。
替代方法的应用不仅可以减少实验动物的使用量,降低检验成本,缩短检验时间,更重要的是保证检验结果的准确性和科学性。同时,替代方法的研究与应用,也是打破国际贸易中一些国家和地区设置的技术壁垒的基保障。
替代方法的研究,特别是验证工作,国际一体化的趋势更加明显,加强国际同类实验室之间的合作研究与验证对推动替代方法的应用至关重要。
5. 狂犬病疫苗效力检定的替代方法
近几年来,为推进3R 原则在生物制品行业中的应用,国际上将特别的关注给予了狂犬病疫苗效价的检测。可能是由于该项检测特别依赖于动物试验、所需的动物数量特别大,而且对动物的伤害和带来的痛苦特别大,因此特别需要尽快找到合适的替代方法。
1)人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会(2011年,美国)
国际生物制品领域权威专业杂志《Biologicals》2012年7月发表了“人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告:科学现状与未来规划”。
这次研讨会于2011年10月在美国爱荷华州Ames国家动物卫生中心举行。来自14个国家的超过80位代表政府、制造商和学术界的科学家参加了研讨会。
目前大多数人用和兽用狂犬病疫苗的效力检定,需要在小鼠中用活狂犬病毒进行攻击实验(NIH法)。参会专家审查了目前在狂犬病疫苗的效力试验中可能减少、优化或替代动物的实验方法的应用和验证现状,对狂犬病疫苗效力检定方法未来的发展方向提出了系统的建议。
i)  鼓励疫苗生产企业进行研究和/或提供历史数据来支持取消目前要求的重复检定。如果以提交生产数据和检定的一致性为条件,监管部门依据单次检定就可发放许可,结果可将使用小鼠的数量减少50%。
制造商应考虑减少试验所用的稀释度的数目,只要这样做并不增加无效检定和进行复检的数量。在进行小鼠效力攻击实验时,最好同时测试多个批次的疫苗,还可同时进行样品稳定性试验。
ii)  在近期可优先采用一种可替代小鼠攻击实验(NIH法)、同时已经验证可确定效力的实验,如:可采用小鼠血清中和抗体试验(SNT)。与攻击实验相比,SNT也有更好的时间效益比(3周对大于4周)。SNT已经完全标准化,欧洲药典委员会已在2012年4月批准将SNT检测纳入修订的欧洲药典专论0451。
iii)  在可行的情况下,特别是对于非佐剂疫苗,鼓励制造商考虑在批签发效力实验中直接改用抗原定量测试。
iv) 狂犬病毒G蛋白的天然折叠形式是与病毒颗粒相联的三聚体形式,具有高度的免疫原性。狂犬病疫苗的效力取决于此类构象完整的G蛋白。用能识别这样的G蛋白的单克隆抗体建立的ELISA方法是狂犬病疫苗效力最好的定量方法。如果可溶性G蛋白的存在会干扰免疫相关蛋白的检测,则应该先将其移除或封闭(或两者都包括)。
v)   不鼓励进一步发展抗体结合试验(ABT单向辐射免疫扩散试验(SRID检测作为效力实验的替代实验,因为它们与小鼠攻击试验的相关性较差,不能区分具有高免疫原性的与病毒颗粒相联的G蛋白与免疫原性较弱的单体G蛋白。然而,SRID分析用于生产过程中检测G蛋白总量可能是有用的。
研讨会提出的建议将有望推动狂犬病疫苗效力试验的替代方法的实施,结果将既能确保人与动物疫苗的安全有效,又能通过优化和减少动物使用而有利于动物的福利。
2)  狂犬病疫苗效价检定替代方法专题研讨会 (2012年,法国)
欧洲动物试验替代方法合作组织(European Partnership for Alternative Approaches to AnimalTesting,EPAAA)于2012年10月又在法国阿卡雄(Arcachon)举办了狂犬病疫苗效价检定(NIH)替代方法专题研讨会。中国食品药品检定研究院曹守春副研究员参加了此次会议。
本次会议的参会人员主要有来自WHO、FDA 和美国CDC等组织、机构和企业负责疫苗质量评价及方法学替代的相关领域专家共计20余人。
法国Noel Tordo教授在关于狂犬病毒及狂犬病疫苗的报告中指出:NIH法目前为WHO推荐的狂犬病疫苗效价测定方法,也是狂犬病疫苗效价测定方法的金标准。 经过对狂犬病疫苗效价测定的多种替代方法的比较,他认为采用ELISA检测糖蛋白抗原含量具有经济、简便和变异系数小等诸多优点,建议优先作为狂犬病疫苗效价测定替代方法进行验证并推广。多 位代表一致认为传统的NIH法不仅变异系数在25%—400%之间,而且耗费小鼠量大,实验周期长,给疫苗批签发工作带来很大障碍,因此NIH法替代方法 的推进和验证工作意义重大。与会专家一致认为对人用狂犬病疫苗效果的评价采用ELISA检测病毒糖蛋白含量来替代传统的NIH法具有良好的应用前景。
我国是全球人用狂犬病疫苗的生产和使用大国,每年的批签发总量在1200万人份左右。企业对狂犬病疫苗成品检验和国家批签发中效价测定任务十分繁重。国内武汉生物制品研究所有限责任公司已研制出狂犬病毒糖蛋白抗原ELISA检测试剂盒, 在国内狂犬病疫苗效价的质量控制中已发挥积极作用。以后应与中国食品药品检定研究院等相关检定部门合作,加速替代方法的推广及验证工作,并建立相应的国家 标准。最终目标是建立起国际认可并适用于国内企业产品的ELISA糖蛋白抗原检测方法以替代动物法效价测定。      
6.与动物保护组织携手前行全 世界每年用于实验的动物数以千万计。据估计,全美一年约有2,800万只动物被用于实验,其中大约1,800万只被杀死。英国每年因实验而死的动物是 251万只,加拿大是166万只,荷兰是73万只。如此巨大的数字不仅引发了动物保护组织的抗议,而且也引起了各国科研部门的注意。
动 物保护已成为一个日益热门的话题。随着动物保护运动影响的不断扩大,许多世界级的大公司为了减少公众的诘难,自20世纪80年代开始,也先后采用了新方 法,替代或是减少实验用动物。比如:雅芳、黛尔、爱丝迪劳德、吉列和露华浓等著名的化妆品公司很早就开始以停止使用动物实验来换取公众的支持。
迄今已经促成55个国家的顾客在一份全球性保证书上签名,承诺支持永远终止化妆品动物实验。
在欧洲,关于实验动物的争论甚至浮上政治层面,成为一些政党、尤其是有“绿色”倾向的政党争取选民的“法宝”。在美洲,近十几年来,在4年一度的美国总统大选中,角逐白宫宝座的候选人没有哪个胆敢不许诺保护动物。
科 研人员应当欢迎3R原则。尽量减轻动物的痛苦及压力,并且在实验最初阶段采用可行的体外试验方法进行危险性评估以减少动物使用量,也节省了金钱与时间。各 个领域的科研人员在推行3R原则方面都已取得了长足的进步。例如:使用新的统计方法可大量减少某些实验动物的使用量而不会降低精确度;转基因技术使得小鼠 对癌症或小儿麻痹等人类疾病更加敏感,可以更快速地筛选出潜在的致病源,并减少疫苗研究中所使用灵长类动物的数目。
当然,3R原则中的“替代”对于某些研究领域或某些研究项目也可能无法完全实现。因为组织培养系统过于简单,根本不能与整体动物的复杂度相比,特别是在神经科学、行为学等研究领域,不用动物实验,有些研究项目就没法进行。在这类情况下,重点应放在“减少”和“优化”。
对于中国企业而言,一旦在产品的生产和检验中违背了3R原则,不仅相关产品将不被市场认可,同时还将面临动物保护舆论的谴责,影响企业形象。因此,相关企业要尽早开展并逐步扩大对动物试验替代方法的研发,在做到尽量不用或少用实验动物的原则下,以科学技术手段保证产品的安全性和有效性。也只有这样,才有可能打破国际贸易中一些国家和地区有意设置的技术壁垒

只有遵循3R原则,大力开发和推广动物实验替代方法,生物制品行业才能确保有光明的未来。

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