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浅谈HPV VLP疫苗进展及纯化技术

VLP是由病毒结构蛋白构成的空纳米颗粒,不含病毒遗传物质。VLP不能恢复或重组成毒性病毒,但它保留了免疫原性表位,可以被树突细胞吞噬;因此能够刺激比亚单位疫苗更强烈的B细胞和T细胞应答。目前少量的预防性VLP疫苗已上市:GlaxoSmithKlin的 Engerix-B® (HBV疫苗)、Cervarix® (HPV 疫苗)、Merck的 RecombivaxHB® (HBV 疫苗)、Gardasil® (HPV 疫苗)以及厦门万泰的Hecolin®(HEV 疫苗)。此外,许多医学重要性病毒的VLP已经使用昆虫杆状病毒表达系统成功合成,并且在动物模型中有效诱导了保护性免疫应答,包括HCV、HIV、HSV、多瘤病毒、细小病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、肠道病毒71型(EV71)以及人和禽流感病毒。根据病毒的自然结构,VLP可能由单一病毒蛋白、多病毒蛋白或者裂解多肽构成。

人乳头瘤病毒VLP疫苗

2014年12月10日,默沙东9价HPV疫苗Gardasil 9获得FDA上市批准,次年6月在欧盟获批上市。9价苗用于9-26岁女性以及9-15岁男性的主动免疫,预防由7种高危型HPV(16、18、31、33、45、52、58)导致的宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌,以及预防由2种低危型HPV(6、11)导致的生殖器疣(尖锐湿疣)。此外,Gardasil 9还可用于预防由这9种基因型HPV(6、11、16、18、31、33、45、52、58)导致的宫颈、外阴、阴道及肛门癌前病变。据默沙东估计,Gardasil 9疫苗所覆盖的7种高危型HPV导致了约90%的宫颈癌病例及80%的宫颈高度病变(宫颈癌前病变,定义为CIN2、CIN3和AIS),其余2种低危型HPV导致了约90%的生殖器疣

表2  全球已上市HPV疫苗信息

葛兰素史克公司用昆虫细胞生产L1 VLP,而默克公司使用的是稳定的 L1 重组酿酒酵母生产体系。葛兰素史克公司的生产系统是相对复杂和昂贵的,而酿酒酵母提供的产率相当低。因此,发展中国家的若干个疫苗生产商正在探索用替代生产系统来生产 L1 VLP 的可能性。厦门万泰沧海生物技术有限公司已利用大肠杆菌获得了高产率的HPV VLP ,该大肠杆菌使用的是获得了专利的 L1 突变体。在2014年,该公司报告了第一阶段安全性试验的结果,并在中国进行 HPV16和18 VLP 疫苗的Ⅲ期临床试验(CTR20130951)。

其他研究机构使用的是大肠杆菌生产五价 L1 VLP。以病毒壳粒为基础的疫苗的主要优点是,这些稳定的亚基比较容易制备并且纯化的产率高。病毒壳粒可以明确地刺激产生体外中和抗体,在动物病毒实验的挑战中保护动物对抗HPV感染。然而,相比于 VLP疫苗,其诱导能力较弱和较不耐用的抗体反应需要在临床试验中得到解决。到目前为止,这种做法并没有得到大企业的赞助。

使用不同类型的酵母来生产 L1 VLP 也正在被评估,这有可能以较低的成本获得更高的产率。印度海德拉巴公司和巴西布坦坦研究所在使用一种毕赤酵母 Komagataella 来生产HPV VLP,印度血清研究所也宣布计划在利用另一个汉逊酵母来生产 HPV VLP。上海泽润利用K 酵母研制的HPV 16和18 VLP 疫苗正在III期临床试验(CTR20140626)。发展中国家的其他一些疫苗生产商,其中包括位于哈瓦那的古巴遗传工程和生物技术中心,越南河内的 Vabiotech,已启动其发展 HPV 疫苗的方案,但方案的具体细节尚未公布。

表3  国内HPV疫苗申报情况

HPV 疫苗拥有广泛的受众并且是目前唯一直接对癌症起到预防作用的疫苗,一经上市就受到了政府与民众极大的重视,因此产品市场培育期非常短。不论是Gardasil 还是Cervarix 都在上市第二年就实现了跨越式放量。尤其是Gardasil,在先发优势和多价优势下占据市场较大份额,而2014 年末9价Gardasil 获批后更是形成了绝对优势。根据2013 年美国CDC 统计,全美13-17 岁女孩HPV 疫苗接种率为37.6%。为进入中国市场,2008 年GSK 展开了针对中国内地的临床试验。次年MSD 也开始了国内的临床,但由于我国药品评审中心采用预防癌前病变而非欧美所使用的预防持续感染作为临床终点指标,两大疫苗在国内的临床之路显得格外漫长。去年7 月18 日,GSK 的Cervarix 获得CFDA 上市许可,成为内地首个获批的HPV 疫苗,引起市场的普遍关注。MSD 的Gardasil 也处于评审阶段,数据核查等进展顺利,有望在年底前获批,2018 年前上市。

 

VLP的下游处理 

疫苗的单剂价格主要取决于生产纯化疫苗的成本。应折中考虑纯度、产量、生物活性和下游处理成本之间的关系,以研制一种低成本高效益的疫苗。使用昆虫杆状病毒表达系统生产VLP的关键是高滴度重组杆状病毒的协同生产。杆状病毒(BV)在哺乳动物细胞中不能有效地复制,所以虽然存在于人类经常摄入的大量蔬菜中,但并未发现有任何的不良反应。虽然有报道称重组BV的基因组可以整合入动物细胞基因组,但这种情况只发生在选择条件下,然而也不能排除重组BV基因组在自然情况下整合入病人的基因组中。此外,重组BV有一定的佐剂活性:如果不将之去除或灭活,或许会诱导出机体不需要的VLP衍生的免疫活性。因此为了获得一种可以用于临床的VLP,必需有效地解决重组BV和宿主细胞DNA的污染问题。由于重组BV和介质(例如:蔗糖)的密度极为相似,所以传统的基于密度梯度的超速离心技术无法有效地去除VLP中的重组BV成分。此外这种技术属于时间和劳力密集型,这点直接影响了生产的扩大。 Novartis公司为使用昆虫杆状病毒表达系统生产的由HA、NA和M1组成的流感VLP研发了一种可放大的纯化工艺。这个工艺包括通过切向流过滤去除细胞,随后采用浓缩/透析去除培养基组分和细胞碎片,然后依据VLP,rBV以及污染DNA之间的电荷差使用离子交换层析法进行分离纯化,接着采用丙内酯灭活残留的rBV和污染DNA,最后使用分子筛层析法去除残余的宿主污染物成分。尽管该纯化工艺可以使rBV失去活性,但是却不能完全地去除rBV颗粒。为提高疫苗质量,在纯化之后对VLP进行再处理是生物制品制备的惯例;已被批准的由昆虫细胞和酵母细胞生产的人用HPV VLP,在经过纯化工艺后还要加入VLP的体外分解和重新装配步骤。这种处理主要是为了获得具有颗粒形态更为一致和最具稳定性的VLP,同时也是为了去除VLP在细胞内装配时带入的杆状病毒或细胞DNA片段污染物。

由于传统的色谱固定相内部只有狭窄的扩散孔,因而其内部传质阻力较大,色谱柱压降较大,对于类病毒颗粒的传质速率、分离效率和结构保持都比较低:而灌注色谱中对流孔的存在可有效地克服传统填料的上述缺点,孔内对流传质大幅削弱了扩散传质速度慢的影响,通过提高填料孔道大小解决类病毒颗粒在分离纯化过程中结构不稳定的问题,而且扩散孔的存在还保证了填料对类病毒颗粒具有较离的吸附容量。在色谱填料上构建超大孔结构,改善填料对于类病毒颗粒纯化的限制。因此,超大孔填料被认为是病毒、类病毒颗粒髙速分离纯化中最具潜力的填料,目前超大孔灌注色谱填料已成功应用于多种类病毒颗粒的分离。

发展于1990年代初的POROS灌注填料己经应用于纯化各种各样的VLPs;Staby等人比较了一系列商品化离子交换填料的载量,发现超大孔填料的载量是所有填料中最高的。Kautto等人利用HQ填料从瑞氏木霉中纯化沉降系数为26 S的蛋白质复合体;Qu等人利用POROS HQ填料对腺病毒衣壳蛋白组成的类病毒颗粒进行了纯化。此外,也有文献报道超大孔填料在蛋白质柱上复性方面具有一定的优势。比如Schmoeger等人研究了重组蛋白在不同填料上的复性速率,发现蛋白在POROS HQ50填料上的复性速率最快。这可能也是因为孔径比较大,一些分子量比较大的可溶性聚集体可进入到孔内。POROS HQ50纯化班豆花叶病毒,纯度很高,速率很快。POROS® HS50(Thermo Fisher Scientific)纯化人乳头瘤病毒11型VLPs,透射电镜可看到纯度很高的病毒(纯化工艺、层析、电镜结果如下图2)。默沙东9价HPV疫苗Gardasil 9均由POROS® HS50纯化而来。

 

展望

目前,厦门万泰和上海泽润的HPV疫苗正在三期临床中,大家也拭目以待,期待能早日上市且惠及国内的广大女性。科学研究者的关注点也开始转移到VLP类型的疫苗,尝试着其他病毒类VLP疫苗的研发,寻找通用的纯化技术也尤为重要。与此同时,超大孔填料己经被广泛应用于病毒样颗粒分离中,他的出现和发展虽然只经历了一个比较短的时间,但是它在病毒样颗粒分离、纯化方面的优越性己经十分明显。他可以减少了填料对病毒样颗粒的天然结构和活性的破坏,且传质和分离速度加快,分辨率和载量提高。因此,目前超大孔填料己经成为分离纯化病毒、类病毒颗粒常用的分离载体之一。未来超大孔填料的研究还需朝着以下几方面继续发展:首先,研究超大孔填料的孔径、表面性质等因素对于病毒、类病毒颗粒等吸附载量和构象变化等方面的影响。其次,继续深入研究超大孔填料对于病毒、病毒样颗粒等的作用机理。最后,继续将超大孔填料应用到其他病毒样颗粒的研究当中。

——Jeff

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